一站式生物药研发生产平台肠道类器官培养基

一站式生物药研发生产平台类器官技术建立在干细胞技术以及经典发育生物学和细胞混合实验的基础之上；类器官的出现无疑是对干细胞研究不懈探索的惊喜回馈。
肠上皮是成年哺乳动物中自我更新最快的组织，自 2007 年，Hans Clevers 实验室就通过谱系追踪 (lineage tracing) 发现肠道 Wnt 靶基因中隐窝基底循环柱状细胞表达的 Lgr5 (leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5, Gpr49) 可作为肠和结肠的干细胞的成体干细胞标志物，这也就是大名鼎鼎的 Lgr5+ 细胞。
2009 年，Hans Clevers 和 Toshiro Sato 用来源于小鼠肠道的成体干细胞培育出首个微型肠道 (Mini-guts) 类器官，开启了类器官技术的发展的“新纪元”。
图 1. 类器官培养发展时间轴[2]
3D 肠类器官由一个封闭的循环中空腔组成，内衬一层肠上皮细胞系。肠上皮的分化细胞系，包括肠上皮细胞，肠内分泌细胞和杯状 (Paneth) 细胞，排列在绒毛状区内。
肠类器官的发育类器官可来源于器官限制成体干细胞 (ASCs) 和多能干细胞 (PSCs) 两种干细胞。这两种干细胞来源产生的类器官包含体内发现的所有肠上皮细胞类型，比例和排列相似。
图 2. 体外培养 ASC 来源的肠类器官[3]
培养类器官的主要成分是细胞外基质和培养基，培养基中添加促肠道发育的生长因子。其中，细胞外基质 (ECM) 为干细胞的粘附、生长和分化提供了必需的结构支持和生化诱因。类器官的形成和生长在很大程度上依赖于培养基成分，这些成分构成了十分接近体内干细胞生态位 (Niche) 的信号通路，以维持干细胞的功能，促进其扩展和分化为器官的特定细胞类型。
如果把肠道类器官培养当成是养成游戏，那么该怎么喂养呢，“定食” 还是“DIY 自助餐”？
图 3. 体外培养 PSC 来源的肠类器官[3]
■ 基础套餐来一套：
肠道类器官培养基的关键成分包括 Wnt-3a (W)、表皮生长因子 (EGF) (E)、Noggin (N) 和 R-spondin-1 (R)，统称为 WENR 培养基。在培养基中有序地添加这些生长因子可调控干细胞生态位信号通路 (包括 Wnt、骨形态发生蛋白 (BMP) 和 Notch 信号通路)，诱导肠道干细胞 (ISCs) 自我更新、增殖和分化。
■ “自助”更有它的妙：
也有一些研究表明，向 ENR 培养基 (包含 EGF + Noggin + R-spondin-1) 中加入其它成分，以诱导干细胞走向特定的分化命运。
例如，引入两种小分子的组合，如 CHIR99021 + Valproic acid 或者是 LDN-193189 + CHIR99021，可协同促进 Lgr5+ ISCs 在自我更新和未分化状态下的维持，得到富含 ISCs 的培养。
通过补充 DAPT + CHIR99021、Valproic acid + IWP-2 或 DAPT + IWP-2 的 ENR 培养基培养可获得分化表型，这些分子相互配合诱导 ISCs 直接分化为 Paneth 细胞 (杯状细胞) 及肠细胞和分泌细胞谱系 (肠内分泌细胞)。也有人认为，DAPT 或 BMP 分子的加入足以促进 ISC 分化并产生多谱系肠类器官。
虽然关于类器官培养基的组成有详细的综述，但不同方案的成分有时会存在差异，在培养技术中需要大量的试验和摸索，以确定剂量和时机，达到预期结果。